עריכת גנום ומערכת CRISPR-Cas9:

• הבדל מעריכה חוץ-תאית (In-Vitro):
  • בניגוד לשיטות קלאסיות של שיבוט דנ"א באמצעות אנזימי רסטריקציה, עריכת גנום מאפשרת לבצע שינויים בתוך התא החי או האורגניזם השלם.
• מקור המערכת:
  • מערכת חיסון נרכשת של חיידקים המשמשת להגנה מפני וירוסים.
  • החיידק חותך את הדנא הנגיפי ומשלב מקטעים ממנו (ספייסרים) בגנום שלו באזור ה-CRISPR, כדי לזהות ולתקוף את הווירוס בהדבקה הבאה.
• מרכיבי המערכת:
  • ה-Cas9: חלבון שהוא אנדונוקלאז (אנזים שחותך דנ"א באמצע הגדיל) שיודע לקשור מולקולות רנ"א.
  • ה-tracrRNA: מולקולת רנ"א שתפקידה לקשור את החלבון Cas9.
  • ה -crRNA (CRISPR RNA): מולקולת רנ"א המכילה את רצף הספייסר שתואם ספציפית לאזור המטרה ב-DNA ונקשר במקביל ל-tracrRNA.
  • רצף PAM (Protospacer Adjacent Motif): רצף קצר (NGG) בדנ"T שחייב להימצא צמוד לאזור המטרה כדי ש-Cas9 יוכל לבצע חיתוך.
  • 
• הפריצה הטכנולוגית (Guide RNA / sgRNA):
  • החידוש שזיכה בפרס נובל (שרפנטייה ודודנה) היה איחוד של ה-tracrRNA וה-crRNA למולקולת רנ"א אחת רציפה שמתקפלת על עצמה, הנקראת Single Guide RNA (או gRNA).
  • פיתוח זה הפך את המערכת לפשוטה מאוד ליישום, שכן נדרש לשנות רק את רצף ה-20 נוקלאוטידים המכווינים למטרה.

מנגנוני תיקון ה-DNA לאחר החיתוך:

• חיתוך דו-גדילי (Double-Strand Break):
  • הקומפלקס מבצע חיתוך בשני גדילי ה-DNA, מה שמאלץ את התא להפעיל מנגנוני תיקון.
• מנגנון NHEJ (Non-Homologous End Joining):
  • חיבור מחדש של הקצוות ללא תבנית. יעיל מאוד אך מועד לשגיאות.
  • מוביל לרוב להוספה או החסרה של נוקלאוטידים (Indels), מה שמשבש את מסגרת הקריאה ומשמש ליצירת נוקאאוט מוצלח לגן.
• מנגנון HDR (Homology-Directed Repair):
  • תיקון מבוסס תבנית.
  • על ידי הכנסת מקטע דנ"א חיצוני (פלסמיד או PCR) בעל קצוות הומולוגיים לאזור החיתוך, התא משתמש בו כתבנית לתיקון.
  • תהליך מדויק המאפשר החלפת מקטע שלם, הכנסת מוטציה ספציפית או גן מדווח, אך הוא יעיל הרבה פחות מ-NHEJ.
• 

יישום CRISPR:

• דרכי החדרת המערכת לתא:
  • פלסמיד:
    • שיבוט ה-gRNA לפלסמיד שמכיל כבר את גן ה-Cas9, והחדרתו לתא בטרנספקציה (אלקטרופורזה, ליפופקטמין) או טרנסדוקציה (באמצעות וירוס).
  • חלבון מוכן מראש (RNP complex):
    • רכישת חלבון Cas9 ו-gRNA מוכנים וביצוע אלקטרופורציה.
    • חוסך את שלב השעתוק והתרגום בתא ולכן נחשב יעיל ומהיר.
• תכנון ה-Guide:
  • שימוש בכלים אינטרנטיים (כמו CHOPCHOP) למציאת רצפים פוטנציאליים התלויים בנוכחות רצף PAM.
• שימושים קליניים וסיכונים:
  • טיפול במחלת האנמיה החרמשית מבוצע כיום מחוץ לגוף (Ex-vivo) - מוציאים תאי גזע של מח העצם, מתקנים אותם עם קריספר ומחזירים לחולה.
  • ה-Off-target effects:
    • הסיכון המרכזי של השיטה.
    • ה-gRNA עלול להיקשר לרצף דומה באזור אחר בגנום ולחתוך שם, מה שיכול לגרום למוטציות בלתי רצויות ואפילו לסרטן.

מערכות מבוססות dCas9 (Dead Cas9):

• עיקרון ה-dCas9:
  • יצירת חלבון Cas9 שעבר מוטציה כך שהוא איבד את היכולת לחתוך דנא, אך שמר על היכולת שלו להיקשר ספציפית לאזור המטרה (בעזרת ה-gRNA).
• מודולטורים CRISPRa (Activation) ו- CRISPRi (Interference):
  • ניתן לחבר ל-dCas9 חלבוני בקרה:
    • אקטיבטור לגיוס רנ"א פולימראז והגברת שעתוק (CRISPRa), או רפרסור להשתקת הגן (CRISPRi).
  • שימושי במיוחד בטיפול ב Haploinsufficiency - מחלה בה אלל אחד פגום ואלל אחד תקין לא מייצר מספיק חלבון. ניתן לכוון את CRISPRa לפרומוטור של האלל התקין כדי להגביר את ביטויו.
• סימון גנטי:
  • הצמדת dCas9 לחלבון מדווח פלואורסצנטי (כמו GFP) כדי לעקוב אחר מיקומי DNA ספציפיים.

עריכת רנ"א כאלטרנטיבה:

• אלטרנטיבות ישנות ל-CRISPR:
  • חלבונים כמו ZFNs ו-TALENs שדרשו תכנון חלבון ספציפי לכל רצף DNA, אשר היוו תהליך יקר, ארוך ומורכב.
• מערכת ה-ADAR (Adenosine Deaminase Acting on RNA):
  • מנגנון לעריכת רנ"א ברמת ה-mRNA בלבד. אנזים אנדוגני (שקיים טבעית בתאים, במיוחד בנוירונים) שנקשר לרנ"א דו-גדילי.
  • מבצע דה-אמינציה: הופך את הנוקלאוטיד אדנוזין (A) לאינוזין (I). הריבוזום בתא קורא את ה-I כאילו היה גואנוזין (G).
  • יישום במחלות נוירו-התפתחותיות (כגון STXBP1-RD):
    • מאפשר לתקן מוטציות שבהן G הפך ל-A. על ידי החדרה של Guide RNA אנטי-סנס ארוך שנקשר ל-mRNA המוטנטי.
    • אנזים ה-ADAR הטבעי בתא מגוייס למקום, והופך את ה-A חזרה ל-I (שנקרא כ-G), וכך מתוקן הקוד הגנטי לשלב התרגום.
• יתרונות עריכת רנ"א מול דנ"א:
  • השתמשות באנזים אנדוגני - דורש רק החדרת guide (ללא חלבון זר כמו Cas9).
  • זמני והפיך ולכן בטוח יותר, ללא פגיעה בדנ"א הגנומי וסיכון מצומצם ל-Off-targets.
  • יעיל בתאים פוסט-מיטוטיים (שאינם מתחלקים) כמו תאי עצב.